Диагностика ДНК

Реализация Проекта человеческого генома (HGP) способствовала бурному развитию генетической диагностики заболеваний, в частности генного тестирования. В настоящее время насчитывают более 4 тыс. наследственных болезней, генетическая природа которых установлена. Они, как правило, относятся к редким и составляют около 3–5% от всех известных заболеваний. Однако среди определенных этнических групп некоторые наследственные болезни встречаются чаще.

Фармацевтические компании разрабатывают или закупают у биотехнологических компаний диагностические тесты, позволяющие быстро и точно анализировать генетический материал тканей организма человека как в клинических целях, так и для проведения научных исследований по разработке новых лекарственных средств (например, для проведения фармакогенетических, фармакотоксикологических исследований, идентификации генов или их продуктов, которые могут служить объектом медикаментозного воздействия и др.). В последние годы на фармацевтическом рынке западных стран появилось много диагностических наборов, предназначенных для выявления генов, ассоциированных с развитием определенных заболеваний, или генов, определяющих особенности метаболизма
лекарственных веществ в организме человека. Например, американская биотехнологическая компания «Affymetrix» с 1997 г. реализует ДНК-тест для анализа 18 известных генетических вариантов двух генов (2D6 и 2C19), относящихся к системе цитохрома Р450.
Поскольку количество генетических тестов постоянно увеличивается, целесообразность их использования в каждом конкретном случае и интерпретация результатов их применения требуют от врачей, а также от пациентов более глубокого понимания основных принципов генетики применительно к различным патологическим состояниям, например злокачественным новообразованиям. При оценке результатов генетических исследований важно учитывать те ограничения, которые имеет каждый из этих тестов. Даже при диагностике хорошо известных моногенных заболеваний (развитие которых обусловлено изменениями только в одном гене) с рецессивным или доминантным типом наследования процент выявления мутаций ниже 100 (за исключением синдрома Хантингтона и ломкой Х-хромосомы). Процент выявления мутаций для таких моногенных заболеваний, как болезнь Дюшенна (ген DMD), гемофилия А (F8C), муковисцидоз (CFTR), составляет 60–90, хотя есть такие новейшие тесты, которые позволяют выявлять мутации в 98–99% случаев. Недостаточная информативность некоторых тестов обусловлена сложной структурой исследуемых генов, а также появлением новых мутаций. Кроме того, определенные наследственные моногенетические заболевания являются генетически гетерогенными, то есть могут развиваться при дефекте одного из нескольких возможных генов. Например, гены BRCA1 и BRCA2 ассоциированы с развитием редкой формы наследственного рака молочной железы (РМЖ), хотя не исключено, что будут обнаружены и другие гены, связанные с этим заболеванием. Еще одним примером может служить поликистоз почек — моногенное заболевание с аутосомным доминантным типом наследования, развитие которого может быть обусловлено мутациями гена PKD1 на 16 хромосоме или гена PKD2 на 4 хромосоме.
Развитие многих заболеваний не всегда обусловлено простыми законами наследования. Даже при наличии доминантного аллеля, например гена BRCA1, ассоциированного с РМЖ, вероятность заболевания человека в возрасте 65 лет составляет 80, а не 100%. Степень вероятности развития заболевания при наличии определенной мутации характеризуется понятием полной или неполной пенетрантности гена. Если ген характеризуется неполной пенетрантностью, то у человека с такой мутацией болезнь может не развиться. Кроме генов BRCA1 и BRCA2, примером неполной пенетрантности могут служить различные аллели гена ApoE, с которыми связан повышенный риск развития у лиц пожилого возраста распространенной (спорадической) формы болезни Альцгеймера. При наличии аллеля ApoE2, ApoE3 или ApoE4 риск развития этой формы заболевания оценивается соответственно как низкий, средний и высокий. Среди заболеваний, характеризующихся полной пенетрантностью, следует отметить синдром Хантингтона и семейный аденоматозный полипоз, приводящий к развитию рака толстой кишки. Для лиц с соответствующими мутациями генов риск развития заболевания составляет 100%. Поэтому прогностические тесты подразделяют на пресимптоматические (предназначенные для прогнозирования развития заболеваний, характеризующихся полной пенетрантностью) и на тесты, определяющие предрасположенность к развитию заболевания (при неполной пенетрантности).

Пока недостаточно информативны генетические тесты в отношении мультифакториальных (или полигенных) заболеваний, развитие которых может быть обусловлено различными мутациями генов, оказывающими комплексное влияние, или совместным воздействием генов и факторов окружающей среды. К ним можно отнести большинство широко распространенных заболеваний (например, сахарный диабет, артериальную гипертензию, злокачественные новообразования, шизофрению, спорадическую форму болезни Альцгеймера и др.). За исключением редких форм этих болезней, которые относятся к наследственным, мутация гена, ассоциированного с заболеванием, не является единственным причинным фактором, а свидетельствует о предрасположенности к заболеванию лиц, у которых она выявлена. Поэтому, если прогностические тесты в отношении некоторых редких форм злокачественных новообразований уже применяются в клинической практике, то тесты для выявления распространенных форм пока только испытываются.

Для клинических целей используют различные методы генетического тестирования. «Генетическое тестирование — анализ человеческой ДНК, РНК, хромосом, белков, ферментов или метаболитов для определения связанных с наследственными заболеваниями генотипов, мутаций, фенотипов или кариотипов в клинических целях» (Final Report of the Task Force on Genetic Testing, Рабочая группа по генетическому тестированию, США, 1997). Генетическое тестирование применяют для выявления носителей рецессивных аллелей генов, которые обусловливают наследственные заболевания, для прогнозирования риска развития заболеваний, для пренатальной диагностики или определения прогноза заболевания, для пренатального скрининга, для преимплантационной генетической диагностики, а также скрининга носителей и новорожденных.

Особенно перспективны методы генного, или ДНК-тестирования, с помощью которых исследуют непосредственно молекулу ДНК. Они относятся к нанотехнологиям и основаны на применении новейших компьютерных, информационных и биотехнологий с использованием автоматизированных систем и лабораторной робототехники. Для генных тестов используют ДНК-зонды (меченые отрезки однонитевой молекулы ДНК с известными последовательностями оснований или участками генов с известными мутациями), которые с помощью различных методов располагают на специальных матрицах (генных чипах или ДНК-чипах) размером с ноготь или предметное стекло микроскопа. Затем наносят исследуемый генетический материал, после присоединения комплементарных участков к ДНК-зондам данные анализируют, например на наличие или отсутствие мутаций исследуемых генов. Различные модификации этих методов используют не только в клинике, но и для научных исследований (поиска генов, определения последовательностей ДНК, экспрессии генов, сканирования и скрининга мутаций и др.), что в свою очередь способствует разработке новых диагностических тестов.

Генные тесты уже эффективно используют в клинической практике. Однако стоимость ДНК-тестирования, проводимого в клинических лабораториях, пока достаточно высока и в зависимости от размеров исследуемых генов, количества тестируемых мутаций и других факторов может колебаться от сотен до десятков тысяч долларов США. Например, некоторые клиники в США при проведении экстракорпорального оплодотворения предлагают будущим родителям, которые относятся к группе высокого риска развития наследственных заболеваний (синдромов Тэя — Сакса, Хантингтона и др.), провести тестирование оплодотворенных ооцитов на наличие соответствующих мутаций генов, после чего для внутриматочной имплантации отбирают только те эмбрионы, у которых отсутствуют гены, ассоциированные с заболеванием. Стоимость такого тестирования составляет 20–25 тыс. долларов.

В 1996 г. был открыт ген, ассоциированный с гемохроматозом, наследственным заболеванием, клинические симптомы которого проявляются у лиц среднего возраста, когда накопление железосодержащих белков в различных органах и тканях может привести к необратимым и не поддающимся лечению нарушениям в организме. Сейчас уже разработан и вскоре появится на рынке ДНК-тест, позволяющий выявлять это заболевание на ранней стадии, когда его лечение может быть эффективным.
Однако применение генных тестов часто сопряжено с некоторыми пока не разрешенными проблемами. Например, прогностическое тестирование людей, относящихся к группе риска развития синдрома Хантингтона, тяжелой прогрессирующей дегенеративной хореи, которая развивается у лиц среднего возраста, при положительном результате свидетельствует о неотвратимости развития болезни в будущем. Но методы эффективной профилактики заболевания не разработаны, поэтому пациенты живут под постоянным психологическим давлением, зная, что их ожидает в будущем. Кроме того, при разглашении информации о данных тестирования существует риск дискриминации со стороны страховых медицинских компаний или по месту работы.

Разработаны также тесты для определения мутаций гена, ассоциированного с развитием муковисцидоза (около 200 долларов США). Однако этот ген имеет большие размеры и постоянно появляются сообщения об обнаружении новых мутаций (сейчас число обнаруженных мутаций достигло 1000). При этом недостаточно точно установлена зависимость между наличием специфической мутации гена и тяжестью течения заболевания. В то же время с помощью имеющихся в продаже ДНК-тестов можно определить только наиболее часто встречающиеся мутации (около 70). Поэтому отрицательный результат тестирования не может полностью исключить наличие заболевания.

Несмотря на проблемы, существующие в области генного тестирования, оно стремительно развивается. Применение геномных технологий в диагностике болезней, создание баз генетических данных, развитие биоинформатики, робототехники — все это будет способствовать и более точному прогнозированию развития заболеваний, применению более эффективных методов лечения и целевой профилактики. Многие специалисты считают, что в ближайшее время будет осуществлен поворот от диагностики и лечения к профилактике. Если сегодня целью диагностики является ответ на вопрос: «какое заболевание у данного пациента», то завтра для эффективной профилактики необходимо будет ставить вопрос так: «у какого человека может развиться данное заболевание?». Комбинация широкомасштабного применения методов генной диагностики, в том числе анализа экспрессии генов, и методов фармакогеномики позволит определять генетически детерминированные особенности метаболизма лекарственных веществ у пациентов и затем использовать специально разработанные для них лекарственные препараты, рекомендовать соответствующий образ жизни, что существенно повысит эффективность лекарственной терапии и снизит риск развития побочных реакций. Понимание особенностей функционирования генов в норме и при патологических состояниях в процессе развития или старения организма, при развитии злокачественных новообразований, при воздействии различных факторов внешней среды позволит контролировать не только развитие моногенетических, но и широко распространенных мультифакториальных заболеваний. Практическое значение генного тестирования увеличится, если будут разработаны и эффективные методы генной терапии.